Этап введения в стерильную культуру

При введении в культуру in vitro прежде всего необходимо отработать методику эффективной стерилизации эксплантов. Общепринятым является использование в качестве антисептиков сулемы и диацида. Это высокотоксичные ртутьсодержащие вещества, опасные для человека и окружающей среды. Нашей задачей было подобрать эффективные и менее токсичные антисептики, более доступные и менее дорогостоящие. В качестве таковых изучены гипохлорит кальция, хлорамин и 70%-ный этанол в качестве вспомогательного и основного агента. Проведенные исследования показали, что данным требованиям в первую очередь отвечает гипохлорит кальция. Уже однопроцентный раствор данного вещества позволяет стерилизовать экспланты луковичных чешуй с высокой эффективностью. Повышение концентрации раствора способствует лучшему подавлению инфекции, но отрицательно сказывается на развитии самих эксплан-тов. В этом случае повышается степень некротизации эксплантов, вследствие чего они снижают способность к регенерации луковичек. Некротизация в еще большей степени проявляется при стерилизации эксплантов хлорамином и этанолом. Обработка эксплантов 10%-ным раствором хлорамина позволила добиться 100%-ной стерильности, однако экспланты развивались заметно хуже, чем при стерилизации гипохлоритом кальция в той же концентрации. Этанол во всех вариантах не позволял добиться такого высокого процента стерильности, как два других антисептика. Увеличение продолжительности обработки эксплантов с 1 до 5 мин не позволяло существенно повысить стерильность, зато заметно возрастало число эксплантов с ожогами.

Таким образом, полученные данные позволяют рекомендовать для стерилизации эксплантов лилий 3%-ный раствор гипохлорита кальция с экспозицией 20 мин. Такой режим стерилизации можно считать наиболее эффективным, поскольку он позволяет получить высокий процент стерильности, и антисептик в такой концентрации не оказывает ингибирующего действия на экспланты.

Как показывают наши исследования, а также данные других авторов [3], добиться полной стерильности сложно. Важная проблема первого этапа микроразмножения - скрытая инфекция эксплантов, которая может проявиться при последующем культивировании in vitro. Поэтому при введении в культуру in vitro необходимо создать условия для более быстрого и полного выявления инфекции. Наш опыт показал, что использование питательной среды МС не позволяет этого добиться. Литературные источники [4] свидетельствуют, что некоторые бактериальные и грибные возбудители, в частности Erwinia и Fusarium, могут не проявлять симптомов в течение многих пассажей. Это одна из причин, по которой питательную среду для первого этапа культивирования готовят без агара [5], или в состав питательной среды вводят ингредиенты, способствующие быстрому прорастанию спор микроорганизмов [3]. Эффективность жидкой питательной среды очевидна, однако по техническим соображениям ее использование представляется достаточно сложным. К тому же использование на первом этапе жидкой питательной среды в производственных условиях представляется затруднительным и весьма затратным. Исходя из этих соображений, было решено остановиться на изучении агаризованных питательных сред. Исследования, проводившиеся ранее А. А. Ивановичем [3], показали высокую эффективность питательной среды Зао для выявления инфекции при введении в культуру in vitro голубики высокой. Поэтому для выявления инфекции на первом этапе нами была изучена данная среда, а также среда МС, дополненная 250 мг/л молочного альбумина (Laktalbumin hydrolysat) в той же концентрации, что и в среде Зао. Данные эксперимента представлены в табл. 5.44.

Уже на 3-й день культивирования на питательной среде МС с молочным альбумином и Зао было выявлено по 41,3 и 41,7% инфицированных эксплантов, в то время как на среде МС только 7%. К 7-му дню культивирования на среде Зао обнаружено 70,3% нестерильных эксплантов, на среде МС с молочным альбумиТаблица 5.44. Динамика выявления инфицированности эксплантов лилий на различных питательных средах

Дни культивирования

Инфицировано эксплантов, %

среда МС

среда МС + молочный альбумин 250 мг/л

среда Зао

3

7,0

41,3

41,7

7

45,7

68,7

70,3

14

56,3

71,7

77,0

21

63,3

74,7

81,0

НСР о.о5 =Н,9

ном - 68,7%, а на стандартной МС - 45,7%. Таким образом, на средах Зао и МС с молочным альбумином уже на 3-й день культивирования выявлено больше половины нестерильных эксплантов.

Обращают на себя внимание и конечные цифры инфицированных эксплантов. Через три недели культивирования на среде Зао их обнаружено 81%, на среде МС с молочным альбумином - 74,7%, а на обычной МС - 63,3%. Таким образом, наиболее быстро и полно обнаружить нестерильные экспланты можно на специальных провокационных питательных средах, таких как Зао или МС с добавлением 250 мг/л молочного альбумина.

Один из важнейших моментов при микроразмножении любой культуры -подбор питательной среды. Основываясь на многочисленных литературных данных, для изучения на первом этапе были выбраны среда МС и ее модификация МС* с изменениями J. A. Simmonds и В. G. Cumming [6, 7], а также В. А. Ру-мынина и А. Г. Слюсаренко [8]. Одновременно изучалось влияние концентрации сахарозы на регенерацию первичных эксплантов из чешуй луковиц. Результаты эксперимента представлены в табл. 5.45.

Результаты показали, что состав питательной среды оказывает существенное влияние на регенерацию эксплантов лилий и прежде всего на коэффициент размножения. Так, у сорта Sun Ray на среде МС он составил 9,2, а на среде МС* -

Таблица 5.45. Влияние состава питательной среды и концентрации сахарозы на регенерацию эксплантов из чешуй луковиц лилий сортов Sun Ray и Trojan

Концентрация сахарозы, г/л

Среда МС

Среда МС*

% регенерации

коэффициент размножения, шт/эксплант

средняя масса луковичек-регенерантов, мг

% регенерации

коэффициент размножения, шт/эксплант

средняя масса луковичек-регенерантов, мг

Sun Ray

30

71,4

9,2

33,4

85,7

6,1

44,2

60

77,0

9,3

55,7

52,4

7,8

55,1

Trojan

30

88,2

5,4

55,1

94,1

5,8

54,6

60

88,0

6,2

89,6

88,0

6,8

67,2

НСРо,О5 (А)

2,1

0,2

2,3

2,1

0,2

2,3

НСР0.05 (В)

2,1

0,2

2,3

2,1

0,2

2,3

НСР0,05 (С)

2,1

0,2

2,3

2,1

0,2

2,3

Примечание. Фактор А - питательная среда; фактор В - концентрация сахарозы; фактор С - сорт.

только 6,1, хотя процент регенерации и средняя масса луковичек в последнем случае выше. Сорт Trojan на состав среды реагировал иначе. На среде МС* у него процент регенерации и коэффициент размножения были выше, чем на среде МС. Увеличение концентрации сахарозы в питательной среде с 30 до 60 г/л оказывало заметный положительный эффект. Во всех случаях заметно увеличивается масса луковичек-регенерантов - на 25-60%. Коэффициент размножения также существенно возрастает, за исключением сорта Sun Ray на среде МС. Особенно это заметно на среде МС* у обоих сортов. Процент регенерировавших эксплан-тов на среде МС при увеличении концентрации сахарозы повышается (у сорта Sun Ray), или остается без изменения. На среде МС* этот показатель, наоборот, уменьшается у обоих сортов. Таким образом, питательная среда МС обеспечивала хорошую регенерацию эксплантов обоих сортов, а ее модификация может быть использована только для сорта Trojan. На основании полученных результатов был проведен еще один эксперимент, целью которого было выявить сортоспецифическую реакцию других генотипов лилий на состав вышеуказанных питательных сред. Исследования проводились с сортами Медуница, Эстафета, Эмилия, Виринея, Болгария и Пелеринка. Полученные результаты позволили сделать вывод, что при наличии определенной сортовой специфики все изучавшиеся основные показатели микроразмножения у всех сортов заметно выше на стандартной питательной среде МС, чем при использовании ее модификации МС*.

Ключевым вопросом при микроразмножении лилий является правильный подбор вида и концентрации экзогенных гормонов. Хотя в литературе имеются данные, что органогенез у эксплантов из чешуй нормально проходит без гормонов с добавлением только небольшого количества сахарозы [9, 10], однако большинство исследователей считают применение гормонов непременным условием ускоренного размножения лилий in vitro. Различными исследователями в зависимости от поставленных задач изучались при микроразмножении лилий практически все известные фитогормоны из группы ауксинов, цитокининов и гиббереллинов. Литературные данные по этому вопросу порой противоречивы. Это можно объяснить сортовой спецификой, различиями в методах работы и т. д.

Одни исследователи [11-17] строили свои схемы клонального микроразмножения лилий на основе непосредственного получения луковичек из тканей экс-планта, в то время как другие [6, 18-20] отдавали предпочтение каллусной культуре. При использовании первой схемы можно получать 100 000 растений из одной луковицы среднего размера в течение полугода [21], a D. Р. Stimart и Р. D. Ascher [13] получали более 8000 луковичек из 100 сегментов луковичных чешуй у L. longiflorum в течение 6 недель. При каллусной культуре можно получить до 6 х 1012 растений в год из 1 г каллуса [7]. Несмотря на столь внушительные цифры большинство исследователей предпочитают прямой метод по следующим причинам: сегменты чешуй луковиц имеют большую регенерационную способность, чем каллус; при каллусной или суспензионной культуре могут возникать значительные хромосомные изменения [22]. Каллусы теряют свою регенерационную способность при длительном субкультивировании, тогда как сегменты чешуй стабильно регенерируют луковички в течение многократных пассажей [23, 24].

При планировании собственных исследований по изучению гормонального состава питательной среды были учтены ранее проведенные исследования, а предпочтение отдано методу прямого органогенеза. Эксперимент проведен с сортами Sun Ray и Trojan. Изучено влияние на процесс регенерации луковичек разных концентраций а-нафтилуксусной кислоты (НУК) и 6-бензиламинопури-на (БАП) как по отдельности, так и в сочетании. Результаты представлены в табл. 5.46. Они свидетельствуют о сильном влиянии изучаемых гормонов на процесс пролиферации луковичек. Реакция исследуемых форм лилий на вид и концентрацию гормонов была сортоспецифичной, однако в целом четко прослеживались общие тенденции. Нафтилуксусная кислота оказывала наиболее существенное влияние на пролиферацию луковичек у обоих сортов. Наличие в среде НУК без БАП способствовало регенерации крупных, хорошо сформированных луковичек с корнями и листьями. При концентрации НУК 0,1 мг/л процент регенерации эксплантов был наибольшим, а масса луковичек - максимальной. Так, у сорта Sun Ray средняя масса луковички в этом случае составила 53,1 мг, тогда как в контроле (безгормональная среда) - только 26,4 мг; у сорта Trojan соответственно по вариантам - 65,1 и 39,6 мг.

В рассматриваемом варианте у сорта Sun Ray коэффициент размножения был высоким - 7,8 по сравнению с 3,8 в контроле, а масса луковичек - максимальной. С повышением концентрации гормона коэффициент размножения увеличивался, а остальные показатели несколько снижались. Наблюдалась сортовая специфика. При увеличении концентрации НУК коэффициент размножения у сорта Trojan возрастал с 2,2 в контроле до 4,8 в варианте с 1 мг/л гормона, а у сорта Sun Ray при высокой концентрации ауксина - снижался.

Результаты эксперимента показали, что БАП без НУК существенно не влияет на регенерацию луковичек. Только в сочетании с ауксином он способствует заметному росту коэффициента размножения. Концентрация БАП 1 мг/л в сочетании с НУК 0,5 и 1 мг/л обеспечивали максимальный коэффициент размножения у обоих сортов. Однако необходимо отметить, что добавление в питательную среду БАП отрицательно влияет на регенеранты. Он подавляет образование корней, особенно в вариантах без НУК. Присутствие в питательной среде БАП в концентрации 0,5 мг/л и выше приводит, как правило, к аберрантному развитию регенерантов. Часто они состояли практически из одних только листьев, а формирование луковичек не наблюдалось. Поэтому для предлагаемой схемы микроразмножения лилий методом прямого органогенеза наиболее подходящим вариантом является использование невысоких концентраций НУК.

Сходные данные были получены Y. Niimi и Т. Onozava [25] при размножении L. rubellum. Они отмечают, что НУК необходима для образования луковичек, а БАП незначительно стимулирует этот процесс. М. Tomita и соавт. [26] установили, что при размножении in vitro ряда видов и сортов лилий НУК стимулирует формирование луковичек в низкой концентрации и подавляет в высокой. БАП в низких концентрациях несколько стимулировал действие НУК и одновременно корней и каллуса, но в высоких дозах он подавлял образование луковичек. Y. Niimi [27, 28] при размножении L. rubellum эксплантами луковичных чешуй

Таблица 5.46. Влияние НУК и БАП на пролиферацию луковичек лилий при введении в культуру in vitro

Концентрация гормонов, мг/л

Сорт

Sun Ray

Trojan

НУК

БАН

% регенерации

коэффициент размножения, шт/эксплант

средняя масса луковички, мг

% регенерации

коэффициент размножения, шт/эксплант

средняя масса луковички, мг

0

0

75,5

3,8

26,4

77,8

2,2

39,6

0,1

0

96,6

7,8

53,1

87,7

3,1

65,1

0,5

0

83,3

9,3

46,5

67,6

4,2

51,6

1,0

0

86,9

6,7

50,3

79,0

4,8

52,6

0

0,1

90,4

5,7

25,9

70,4

2,1

55,1

0,1

0.1

85,8

7,6

36,2

81,4

3,8

32,2

0,5

0,1

91,5

10,2

31,3

65,8

3,8

49,5

1,0

0,1

66,7

7,4

32,8

77,8

4,8

33,1

0

0,5

79,0

5,8

41,9

85,7

3,7

28,2

0,1

0,5

95,2

8,2

38,7

91,0

4,5

30,4

0,5

0,5

100,0

8,1

44,4

87,9

4,2

27,6

1,0

0,5

100,0

8,6

39,2

91,6

6,7

23,3

0

1,0

89,6

5,9

44,7

85,8

3,2

38,9

0,1

1,0

95,8

8,4

43,5

95,8

6,2

29,7

0,5

1,0

77,7

10,9

37,7

93,3

7,2

29,7

1,0

1,0

81,5

11,0

35,0

83,6

6,8

24,8

НСР005 (А)

4,9

0,1

2,2

4,9

0.1

2,2

НСР0.05(В)

10,4

0,2

4,6

10,4

0,2

4,6

Примечание. Фактор А - сорт; фактор В - гормоны.

и сегментами листьев лучшей считает концентрацию НУК 0,1 мг/л. Концентрации НУК 1 мг/л и БАП 0,1 мг/л вызывали аберрантный рост луковичек.

J. van Aartrijk и G. J. Blom-Barnhoorn [17] пришли к выводу, что цитокинины (БАП и 2 iP) не влияют на регенерацию эксплантов и приводят к аберрантному развитию регенерантов. Исследования этих авторов совпадают с нашими как по влиянию БАП, так и по сортовой реакции Азиатских сортов лилий.

На основании результатов описанного выше эксперимента в последующем была изучена реакция сортов Медуница, Эстафета, Эмилия, Виринея, Болгария и Пелеринка на разные концентрации НУК. При наличии очевидных сортовых различий четко прослеживались следующие тенденции. При увеличении концентрации НУК с 0,1 до 1 мг/л у всех сортов снижался процент регенерировавших эксплантов, а при увеличении коэффициента размножения уменьшалась средняя масса луковичек-регенерантов. Это позволяет сделать вывод о целесообразности применения на этапе введения в культуру in vitro невысоких концентраций НУК - 0,1-0,5 мг/л.

Интересным представлялось изучить влияние брассиностероидов на процесс регенерации лилий in vitro. Литературных данных на момент проведения исследований по данному вопросу не обнаружено. Нами было изучено влияние эпибрассинолида на регенерацию эксплантов перечисленных выше Азиатских сортов лилий. Добавление в питательную среду указанного гормона в концен трации от 0,01 до 1 мг/л оказывало существенное влияние на экспланты. Во всех вариантах с эпибрассинолидом регенерация эксплантов начиналась заметно раньше. Коэффициент размножения по сравнению с безгормональной средой повышался. Одновременно при всех концентрациях гормона, наблюдался каллусо-генез. В вариантах с высокой концентрацией эпибрассинолида (0,5 и 1 мг/л) этот процесс шел слишком активно, в ущерб пролиферации луковичек. При совместном использовании НУ К 0,1 мг/л и эпибрассинолида 0,1 мг/л, а также БАП 0,5 мг/л и эпибрассинолида 0,1 мг/л процесс каллусогенеза преобладал над регенерацией луковичек. Наблюдались многочисленные аберрации в развитии регенерантов. На основании проведенных исследований был сделай вывод о нецелесообразности применения эпибрассинолида для размножения лилий in vitro по предлагаемой схеме методом прямого органогенеза. Однако полученные данные представляют несомненный интерес для проведения селекционного процесса, изучения теоретических и практических вопросов физиологии растений в культуре in vitro.

Важным моментом на первом этапе микроразмножения является выбор экс-планта. Известно, что практически любой орган растения может служить источником эксплантов. Большинство исследователей микроразмножения лилий используют для этих целей чаще всего луковичные чешуи. Однако перспективной представляется возможность использования в качестве источников эксплантов различных вегетативных и генеративных органов. Это позволило бы увеличить коэффициент размножения и продлить сроки изолирования эксплантов. В данном случае не требовалось бы уничтожать луковицу, что особенно актуально для единичных ценных селекционных образцов, а стерилизацию можно было бы проводить проще и с меньшими усилиями. Исследования J. Niimi [25], проведенные с L. rubellum показали, что перспективно использовать в качестве источника эксплантов листья, причем наиболее активно в плане регенерации их основания. Более поздние исследования этого автора [29] свидетельствуют, что экспланты листьев данного вида лилии имеют более высокий коэффициент размножения, чем экспланты чешуй. Возможно также применение в качестве источника эксплантов стебля, цветоноса [9] и листочков околоцветника, хотя это менее эффективно. F. J. Novak и Е. Petru [11] также показана возможность размножения лилий in vitro с помощью листьев и завязей.

Для изучения этого вопроса был проведен эксперимент с сортом Арктика из группы Азиатских гибридов. Экспланты из листьев и стебля, изолированные в два срока (за 10-12 дней до цветения и во время массового цветения) не обладали способностью к регенерации. Целесообразным оказалось использовать в качестве эксплантов лишь сегменты цветоноса. Наиболее активной в плане регенерации была зона цветоноса, непосредственно прилегающая к бутону. При изолировании рассматриваемых эксплантов до цветения коэффициент размножения составлял 3,3, во время цветения - уже только 2,0. При этом в первый срок изолирования экспланты регенерировали крупные луковички средней массой 77,1 мг, а во второй - всего 10,2 мг. В качестве контрольного варианта в данном эксперименте рассматривались экспланты луковичных чешуй. В оба срока изолирования они имели преимущества по всем показателям микроразмножения.

Важен вопрос о возможности использования в качестве эксплантов всех че-шуй луковицы. По данным Н. В. Ивановой [30], экспланты чешуй внутренней зоны луковицы не способны к регенерации луковичек. Наши данные свидетельствуют об обратном. Проведенные с сортами Медуница и Эстафета исследования показали, что экспланты из чешуй обоих зон луковицы хорошо регенерируют луковички. Эксперимент проводился в трех повторениях - в сентябре, январе и мае. Во всех случаях экспланты чешуй обоих зон луковицы имели хорошие показатели микроразмножения, хотя наблюдались различия как по сортам, так и по сроку изолирования и по происхождению экспланта. При изолировании в январе экспланты внутренних чешуй имели более низкий коэффициент размножения по сравнению с эксплантами внешних чешуй, а при изолировании в мае и сентябре - такой же или даже более высокий. Это можно объяснить физиологическим состоянием луковицы, возрастом чешуй и концентрацией эндогенных фитогормонов. При изолировании эксплантов в сентябре концентрацию ПУК следует повышать до 1 мг/л. В данный период луковицы находятся в стадии физиологического покоя и, следовательно, содержат высокие концентрации эндогенных ингибиторов.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ   ОРИГИНАЛ   След >